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視頻標簽：血紅蛋白的,提取和分離
所屬欄目：高中生物優質課視頻
視頻課題：人教版高中生物選修1生物技術實踐課題5.3血紅蛋白的提取和分離-湖南省優課
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課題5.3 血紅蛋白的提取和分離
教學目標：
1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白
2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 教學重點：凝膠色譜法的原理和方法
教學難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 教學過程：
（一）引入
蛋白質是生命活動的主要承擔者，是細胞內含量最高的有機化合物。對蛋白質的研究有助于人們對生命過程的認識和理解。所以需要從細胞中提取蛋白質進行研究。怎樣提取蛋白質呢？
（二）新課 1．基礎知識
血紅蛋白存在于什么細胞中？ 怎樣使其釋放出來？
如何使血紅蛋白與其他蛋白質分離開？
蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。
1．1凝膠色譜法（分配色譜法）： （1）原理：（見課件圖） 分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。
（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。
（3）分離過程：
混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。 1．2凝膠電泳法：
（1）原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。
（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經膠電泳等。
（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質－SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。
1．3緩沖溶液
（1）原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），調節酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。
（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩定。
2．實驗設計
2.1蛋白質的提取和分離一般分為哪些基本步驟？ 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。
2.2選擇實驗材料
（1）你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？
（2）請閱讀投影資料，認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質。并思考回答下列問題：
血液由 和 兩部分組成。
血細胞中 細胞數量最多，細胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2
和CO2結合的 基團。
2.3從紅細胞中分離出血紅蛋白的過程為：洗滌紅細胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細胞的目的是什么？
紅細胞的洗滌過程為
血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細胞＋5倍體積生理鹽水 →緩慢攪拌10min→低速短時離心→吸出上清液→反復洗滌直至上清液無黃色
紅細胞破碎混合液→中速長時離心（2000c/min×10min）→濾紙過濾除去脂
思考：是否所有種類的蛋白質的提取和分離都是這樣的？為什么？ 不是。因為蛋白質的來源和性質不同，分離方法差別很大。
哺乳動物血液。因為該細胞中沒有細胞核，血紅蛋白含量高。 除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續步驟的分離純化。 思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？
防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考：你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？ 加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。
補充：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時，紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細胞破碎物、脂質、甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質呢？由于它們的密度不同，科學家采取了離心分離的方法：
質→分液漏斗分離出血紅蛋白
在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散進入到pH＝7的磷酸緩沖液中。
總結：通過以上四個基本過程，紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢？我們來研究蛋白質提取和分離的第二個步驟――粗分離（凝膠色譜操作）。
2.5凝膠色譜分離蛋白質包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據教材圖5－19，說出制作色譜柱需要的材料。
橡皮塞2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過程：準備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱 下面進行第二步――凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材： 色譜柱的裝填過程。
步驟
操作要求
① 操作要求 色譜柱垂直固定在支架上 ② 計算稱量凝膠 根據色譜柱體積計算凝膠用量 ③ 配制懸浮液 凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹 凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴 ④ 裝填懸浮液 一次性緩慢倒入；輕輕敲打 ⑤
緩沖液洗滌平衡
立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h
樣品加入和洗脫。其基本過程是：
調節緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質 至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中，應當注意以下事項： （1）紅細胞的洗滌：洗滌次數不能過少；低速、短時離心。 （2）凝膠的預處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡
（3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。
（4）色譜柱成功標志：紅色區帶均勻一致地移動。 （三）課堂總結
思考：如何除無機鹽離子和小分子有機物質呢？。
透析。半透膜的選擇透過性，大分子物質不能通過半透膜，離子和小分子能夠通過半透膜。 思考：為何使用pH＝7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量？ 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質分子充分地向外擴散。
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